Protocole et procédures de prélèvement
dans le cadre du programme BIOindicateurs II


Le protocole de prélèvement appliqué dans le cadre du programme a été discuté collectivement afin de répondre aux objectifs de chaque équipe. Il a été appliqué sur chaque site par une même équipe de préleveurs (assurant la qualité des prélèvements), l’ensemble des prélèvements étant coordonné par l’Université de Rennes 1 (UMR EcoBio, Daniel Cluzeau) qui avait précédemment réalisé le même travail dans le cadre du programme RMQS BioDiv (Cluzeau et al., 2012).
Le dispositif s’est basé sur les recommandations du groupe de travail du programme Européen ENVASSO (Bispo et al., 2007; Kibblewhite et al., 2008) ainsi que sur le dispositif appliqué dans le programme national RMQS BioDiv (Cluzeau et al., 2009 ; Cluzeau et al., 2012) et répondait à la norme ISO d’échantillonnage 2311-6 : 2012.

Chaque zone de prélèvement a fait ainsi l’objet d’une stratégie d’échantillonnage identique afin d’être en mesure de comparer les données issues des différents sites. Les prélèvements ont été réalisés sur une zone d’une surface de 100 m² (10 m X 10m) sur chaque modalité, sub-divisée en 4 répétitions de 25 m² (Figure ci dessous). Dans le cas de sites expérimentaux organisés en bloc (cas de QualiAgro-Feucherolles, BioREco-Gotheron et Thil), les répétitions ont été réparties sur chaque bloc.

Compte tenu des contraintes des indicateurs étudiés, les prélèvements de sol (pour microorganismes et microfaune) et de faune (méso et macrofaune) ont été réalisés en même temps (au printemps) alors que la flore a été échantillonnée ultérieurement, au moment le plus propice du stade de développement (mai-juin). Pour les mêmes raisons, l’étude des bioindicateurs « escargot » et « micromammifères » a été faite au mois de mai-juin.




Afin de pouvoir optimiser la mesure de certains paramètres biologiques, les prélèvements de sols ont été réalisés systématiquement en tout début de semaine sur les sites afin d’expédier les échantillons le plus vite aux laboratoires (livraison par Chronopost contenant des accus froids pour maintenir une température optimale). De ce fait, dans le cadre de ce programme, seul un site a pu être échantillonné par semaine. Les différentes étapes du prélèvement sont détaillées ci-après.

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Etape 1 : Positionnement de la zone de prélèvement et localisation par GPS

Sur les conseils des gestionnaires de sites, la zone de prélèvement est positionnée et individualisée par du ruban de chantier ; de même les répétitions sont délimitées et leur angle extérieur est enregistré par GPS.
Avant tout prélèvement, dans chaque répétition, la localisation des futurs prélèvements est identifiée par un jalon afin de ne pas avoir de perturbation ultérieure (piétinement).




Etape 2 : Prélèvements composites de sol


Prélèvement de sol par carottier (7 cm de diamètre) sur 0-15 cm de profondeur (en système forestier, les horizons OL et OF sont enlevés, leur épaisseur respective est notée; le prélèvement de sol se fait donc en intégrant l’horizon OH et A). Douze carottages sont réalisés par répétition de manière aléatoire, puis associés et répartis de manière homogène pour aboutir à un échantillon composite qui sera ensuite subdivisé en parts égales. Afin de répondre aux besoins de différents paramètres biologiques :
Ces échantillons sont pesés et expédiés aux différents laboratoires pour analyse.
L’extraction d’ADN a été réalisée par un seul laboratoire (GenoSol) qui a ensuite redistribué les ADN aux différents laboratoires concernés, permettant l’étude des paramètres suivants : empreinte moléculaire des communautés microbienne, diversité taxonomique microbienne, biomasse moléculaire microbienne ou fongique.



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Etape 3 : Prélèvement des échantillons de sols pour la mésofaune

Il se fait selon la méthode normalisée ISO 23611-2 : 2006. Les prélèvements (1 par répétition) sont réalisés à l’aide d’un plexis (6 cm de diamètre) sur une profondeur de 5 cm. Les échantillons sont envoyés directement au laboratoire qui réalise l’extraction de la mésofaune ainsi que sa détermination au niveau groupe fonctionnel.





Etape 4 : Prélèvement des lombriciens



Ils sont prélevés selon la méthode adaptée de la norme ISO 23611-1 : 2006 qui combine une extraction chimique (formol) et un tri manuel. Un prélèvement est réalisé par répétition. Les lombriciens prélevés sont rapportés au laboratoire où ils sont déterminés finement au niveau spécifique et pesés individuellement.



Pour l’étude des biomarqueurs lombriciens, une solution formolée (Bouché, 1972) est appliquée à la surface du sol, les lombriciens récoltés sont rincés à grande eau. Douze individus (adultes de préférence) d’une même espèce sont envoyés vivants dans des boîtes plastiques contenant leur sol d’origine, pour être ensuite analysés au laboratoire.

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Etape 5 : Prélèvement de la macrofaune totale

(prélèvement réalisé par l’équipe de IRD Bondy ou par équipe de l’INRA-PESSAC).
Ces prélèvements sont réalisés suivant la méthode TSBF (Tropical Soil Biology and Fertility) modifiée pour être adaptée aux milieux tempérés (Lavelle, 1988 ; Anderson et Ingram, 1993) (norme : 23611-5, 2011). Cinq répétitions sont réalisées par modalité. Cette méthode combine l’extraction au formol (1,5 L de solution à 0.2% déversé 2 fois à dix minutes d’intervalle) et un tri manuel d’un bloc de sol (25 cm x 25 cm sur 15 cm de profondeur). Les organismes récoltés sont conservés dans une solution à 4%, et rapportés au laboratoire où ils sont déterminés au niveau de l’ordre, puis si possible au niveau de la famille ou du genre.



Les étapes suivantes (6 à 8) ont été menées par les équipes porteuses du paramètre biologique, et selon des dates et des protocoles adaptés à ce paramètre.



Etape 6 : Etude du bioindicateur Escargot

La bioaccumulation a été étudiée sur des escargots de l’espèce Cantareus aspersus (syn. Helix aspersa) placés dans des microcosmes (cylindre en inox 25x25cm) sur le terrain. Les escargots sont laissés sur site pendant un temps défini (28 jours) puis ramenés au laboratoire pour être analysés (spectrométrie d’absorption, SAA ou ICPMS).



Etape 7 : Etude du bioindicateur Micromammifère

La bioaccumulation chez les micromammifères a été étudiée uniquement sur le site d’Auzon, sur 3 secteurs présentant un gradient de contamination sur des surfaces adaptées à l’aire de vie de ces vertébrés. Les micromammifères sont échantillonnés par piégeage létal. Les micromammifères capturés sont congelés et rapportés au laboratoire pour être analysés.

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Etape 8 : Etude des paramètres végétaux

La liste des sites sur lesquels les paramètres végétaux ont été étudiés est reportée dans le tableau ci-dessous.





Dans un premier temps, la végétation de chaque modalité a été prospectée afin d’identifier les principales espèces dominantes représentatives des zones étudiées. Les prélèvements des végétaux ont ensuite été réalisés en fonction de la répartition des espèces végétales présentes et en fonction de l’indicateur étudié :
  • Bioaccumulation des ETM : 2 stratégies de prélèvements ont été réalisées : i) la première (sur Métaleurop, Auzon) a consisté à étudier les concentrations métalliques foliaires dans des échantillons prélevés individuellement : les parties aériennes de 10 espèces dominantes ont été prélevées de façon indépendante. ii) la deuxième stratégie (sur tous les sites) a consisté à étudier les concentrations métalliques foliaires dans des échantillons composites (« pool ») : les parties aériennes de 5 espèces différentes présentes dans une même zone ont été prélevées et cet échantillonnage élémentaire a été répété 5 fois sur chaque modalité, en utilisant si possible des mélanges d’espèces différentes entre chaque réplica.

  • Oméga 3 : 4 à 6 espèces dans la mesure du possible communes à chaque parcelle ont été identifiées. Un morceau de feuille de chaque espèce végétale est découpé à l’aide d’un ciseau et les tissus foliaires prélevés sont placés dans des tubes en verre contenant un mélange de méthanol et d’acide sulfurique, puis rapportés au laboratoire pour être analysés.

  • Photosynthèse : 5 espèces végétales différentes communes à chaque modalité ont été identifiées. Les paramètres caractérisant le fonctionnement des systèmes photosynthétiques ont été mesurés directement sur le terrain : Photosynthèse nette (Pn) a été mesurée sur chaque échantillon, les autres paramètres (qP, PSII, Fv/Fm…) ont été mesurés sur des feuilles intactes.

  • Dendrochimie : Sur le site de Métaleurop, 5 arbres ont été échantillonnés (Quercus robur et Acer pseudoplatanus) sur différentes modalités et 10 arbres (Quercus robur) ont été échantillonnés sur l’ensemble du site d’Auzon. Pour chaque arbre, deux carottes de bois (superposées) à 1,30 m dans le tronc, ont été prélevées complétée par un prélèvement d’écorce (avec un emporte-pièce). Les mesures micro-élémentaires ont ensuite été effectuées au laboratoire par spectrométrie à dispersion d’énergie (EDS) et spectrométrie à sélection de longueur d’onde (WDS). Ces techniques permettant une mesure semi-quantitative d’une large gamme d’éléments, couplées avec une interface d’imagerie (microscope électronique à balayage).

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Organisation générale

Compte tenu du nombre important de sites, et des contraintes de prélèvement liées aux paramètres biologiques qui font que ceux-ci ne peuvent être mesurés qu’en période d’activité favorable (printemps ou automne), il a été décidé de réaliser une première campagne de prélèvements au printemps 2009 (échantillonnage des sites de la moitié Nord de la France) et d’échantillonner au printemps 2010 les sites situés dans la partie Sud, le site de l’ANDRA ayant été échantillonné au printemps 2011.






Bibliographie






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